粪菌移植进入洗涤菌群移植时代

发表时间:2020-02-09 14:00

照片为本文第一作者 张婷 & 陆高辰

张婷、陆高辰(菌群平台微信公众号)

粪菌移植美学之殇:

人类科技发展已经达到从未有过的高度,“可上九天揽月,可下五洋捉鳖”,但是,人类从未摆脱用人的粪便给人治病的现实需求(Zhang,et al. 2018)。古人使用美化的名词“金汁”、“黄龙汤”,虽然智慧满满,但受限于技术,也实属无奈。

时至2011年,粪菌移植(fecal microbiota transplantation,FMT)将“粪便移植”取而代之,作为规范的学术交流名词,目的只是导向认识这一技术的本质,并未改变实施方式。然而,调查研究表明:广泛存在医生、医学生、供体和患者因为粗糙的手工制备方式而对FMT持消极态度;医生群体比患者更不愿意向他人推荐使用FMT。这一现象归因于原始的手工制备流程,不能简单以“不怕苦、不怕累、不怕脏”来道德绑架医务人员急患者之所急。

FMT的医学价值已经在全世界大量的研究中得到认可,可以从“热心肠日报”搜索任意检索词就可以得到大量的研究证据。

思考1:如何将FMT的益处带给那些真正需要FMT的患者?

思考2:如何将FMT的安全和质量控制做得更好?

至少,不能道德绑架医务人员。

至少,必须知道,传统的手工FMT还很粗糙。

美国Surawicz教授在2013年接受美国西雅图时报记者采访时说,相信未来5年的时间,这一粗糙的方法将会被新的方法所替代。

2012年的时候,我们就开始致力于全新的FMT方法学研究。

粪菌移植安全性之殇:

安全性和疗效是评估一项治疗技术的最重要特征。对于FMT的远期安全性,需要更长的随访和研究,目前FMT的短期不良事件主要包括发热、腹泻、腹胀等,严重的出现耐药菌感染致死,如何降低或避免FMT的不良事件发生率是被广泛关注和亟需解决的问题。

洗涤菌群移植(WMT):

随着世界上第一套智能粪菌分离系统(GenFMTer, Nanjing, China)在2014年进入实验室应用,FMT的发展进入了新的阶段。2019年底,我们在《Protein & Cell》杂志发表的文章提出“洗涤菌群移植(washed microbiota transplantation, WMT)”概念并发表其与手工FMT的对比证据。

FMT的安全性与有效性是大家最关心的问题。基于中国菌群移植平台提供的真实世界数据,从2012年10月25日截止至2019年10月10日,对比“洗涤”和“手工”制备过程,WMT后总不良反应事件发生率(包括发热、腹泻、腹痛、腹胀、恶心、呕吐等)在溃疡性结肠炎(ulcerative colitis, UC)患者中从38.7% 降低至 12.3%,在克罗恩病(Crohn’s disease, CD)患者中从21.7%降低至4.26%。更令人欣慰的是,洗涤的过程在提高FMT安全性的同时并未降低其疗效,这在本团队已发表的两项关于UC(Ding et al., 2019)和CD(Wang et al., 2019)的临床研究中可以找到证据。

WMT富集的洗涤菌群,使移植入患者体内的细菌有了“量化”的标准,而非单纯依靠手工制备时对粪便称重这种粗略的估计方式。因为我们发现供体的粪便重量与最终富集得到的菌泥体积的相关性并不高,在儿童和成人供体中均是如此。并且同一供体在捐献相同重量的粪便时,每次获得的菌泥体积也不相同。本研究首次报道以洗涤菌群数量为衡量指标的剂量和计量依据。

基于上述临床发现,我们开展了一系列的研究来反向证明WMT的优秀之处,并探索其发挥重要价值的机制。

小鼠腹腔注射粪菌上清液:副反应的放大器

为评估离心洗涤过程的质量,从探究上清液的毒性入手,将不同洗涤次数的粪菌上清液注射至小鼠腹腔,发现注射只经过1次离心洗涤的粪菌上清小鼠死亡率为70%,而洗涤2次以上的粪菌上清未导致小鼠死亡,表明离心洗涤次数是影响粪菌毒性的重要因素。

接受离心洗涤3次后上清注射的小鼠的血液和组织的炎症相关指标与腹腔注射生理盐水最为接近,而离心洗涤3次以上则和3次无差异,表明离心洗涤3次是确保粪菌上清液的安全性是一个比较好的选择。

图3  不同次数离心洗涤上清6小时血细胞变化

 图4  不同次数离心洗涤上清24小时血细胞变化
图5  6小时脾脏病理变化

上清液的病毒学分析

mNGS测序分析发现离心洗涤3次上清组所测得的病毒种类与数量均升高,这些病毒可能与供体摄入的食物相关。目前有关这些病毒的研究仍比较局限,但未有文献报道其对人体的致病性,并且在所有检测到的病毒中未发现已知的致病病毒。生理盐水或可作为一种载体液将病毒从菌群中洗脱到上清液中。

上清液的代谢产物分析

通过LC/MS对离心洗涤1次和3次上清进行差异代谢物分析发现,具有促炎效应的代谢物在前者中的数量明显多于后者,包括白三烯4、前列腺素G2等。与此同时,一些检测到的差异代谢产物富集的通路也被证实与促炎反应有关。而在离心洗涤3次得到的上清中,具有抗炎效应的代谢物数量明显增加,例如白藜芦醇、对乙酰氨基酚。同前一致,上述结果再次支持WMT的安全性。

图6 差异代谢产物及富集的通路

上清液的近红外光谱快速检测质控

为快速鉴定离心洗涤不同次数所获上清的质量,利用近红外光谱检测技术将其物理性质与生理盐水比较,结果表明随着粪菌上清洗涤次数的增加,其光强逐渐增强并趋近于生理盐水,同时吸光度逐渐减弱并趋近于生理盐水。这是物理检测方法应用于WMT过程中控制洗涤上清质量的初步探索,是通过光谱技术建立WMT的质控方法的初步探索。

结 论

综上所述,本研究整合来自临床、动物和体外实验的证据,首次提出WMT概念,证明WMT在量化和质控移植的洗涤菌群、提高临床治疗安全性等方面明显优于传统的手工制备FMT。WMT将会鼓励更多的研究人员在实验室中使用这种更可靠的制备方式来获得富集的菌群,并在临床实践中推动FMT由手工制备阶段正式进入WMT时代。

文章来源:Ting Zhang, Gaochen Lu, Zhe Zhao, et al. Washed microbiota transplantation vs. manual fecal microbiota transplantation: clinical findings, animal studies and in vitro screening. Protein & Cell. 2020

原文链接:https://link.springer.com/article/10.1007/s13238-019-00684-8